THIẾT BỊ-DỤNG CỤ-HÓA CHẤT-TEST KIT

Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy phân lập vi khuẩn

20/03/2017 / Trong danh mục Kiến thức hổ trợ

Kỹ thuật pha chế môi trường nuôi cấy phân lập vi khuẩn

Để xét nghiệm chẩn đoán chính xác vi khuẩn gây bệnh trong phòng thí nghiệm, cần phải sử dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy. Đây là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn. Nếu môi trường không đảm bảo chất lượng sẽ cho kết quả sai trong chẩn đoán xác định vi khuẩn gây bệnh. Bên cạnh đó việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy cách cũng là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn.
          Cho đến nay, có nhiều loại môi trường khác nhau được dùng cho phân lập và định danh vi khuẩn, và thường được xếp thành 3 loại chủ yếu là: Môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường tăng sinh vi khuẩn (có giầu chất dinh dưỡng) và môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học. Mỗi loại môi trường sẽ được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
          Có thể pha chế môi trường từ hoá chất riêng lẻ hoặc từ bột khô đóng hộp. Tuỳ loại môi trường cần hấp khử trùng (có loại môi trường không cần hấp khử trùng) theo chỉ dẫn trên hộp môi trường. Cần ghi ngày mở hộp môi trường và kiểm tra hạn sử dụng. Trước khi pha chế phải kiểm tra môi trường và hóa chất bảo đảm tinh khiết, khô, không vón cục, không đổi màu, còn hạn sử dụng.
     I. Môi trường tự pha chế

 

     1.1. Các môi trường nuôi cấy cơ bản

 

          Môi trường cơ bản là môi trường đơn giản chứa các chất cơ bản như CO2, N và các chất khoáng giúp các vi khuẩn không yêu cầu các chất dinh dưỡng đặc biệt thường được sử dụng để chuẩn bị các môi trường tăng sinh và cấy chuyển các vi khuẩn gây bệnh.

          1.1.1 Môi trường canh thang thường

          – Công thức:

Pepton
NaCl

Cao thịt

Nước cất
10g
5g

4g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4-7,6. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút.

1.1.2   
Môi trường thạch thường (Thạch dinh dưỡng)
           – Công thức:
Pepton
NaCl
Cao thịt

Thạch

Nước cất
10g
5g
4g

20g

1000ml

          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4-7,6. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống thạch cho thạch đông.Nếu đổ đĩa: Sau khi hấp, để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

          1.1.3 Môi trường Pepton thường

          - Công thức:

Pepton

NaCl

Nước cất
20g

5g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,2-7,4. Đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút.

          1.1.4 Môi trường Peptone Kiềm

          – Công thức: 

Pepton

NaCl

Nước cất
10g

10g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 8,5-9, đóng ống 16mm mỗi ống 6ml. Hấp 121oC/15 phút.

          1.1.5 Môi trường Selenit

          - Công thức:

Bột khô Selenit

Biselenit

Nước cất
19g

4g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hòa tan hoàn toàn các thành phần trong 5 phút, đóng ống 16mm mỗi ống 5ml trong hốt vô trùng.

          1.1.6 Môi trường thạch mềm giữ chủng

          - Công thức: 

Pepton
NaCl
Cao thịt
Cao men

Thạch

Nước cất
10g
5g
3g
6g

6g

1000ml
Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,6, đóng ống 12mm, mỗi ống 3-4ml. Hấp 121oC/15 phút.
1.2. Môi trường phân lập
          Môi trường phân lập dùng để tách một chủng vi khuẩn ra khỏi những vi khuẩn khác hoặc thu một chủng vi khuẩn thuần khiết.

          1.2.1 Môi trường thạch máu

          – Công thức:

Pepton
NaCl
Cao thịt
Thạch

Nước cất

Máu thỏ hoặc máu cừu
10g
5g
4g
20g

1000ml

50ml (Máu 5%)
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Màu thạch đỏ tươi là đạt tiêu chuẩn. Nếu môi trường màu ngả đen là máu đã chín. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

          1.2.2 Môi trường thạch Socola (Chocolate)

          – Công thức:

Pepton
NaCl
Cao thịt
Thạch

Nước cất

Máu thỏ hoặc máu cừu
10g
5g
4g
20g

1000ml

50ml (Máu 5%)
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4-7,6. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C, cho 50ml máu vào quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch. Cho vào đun cách thủy 800C/10 phút, chú ý luôn lắc tròn bình thạch. Để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

          1.2.3 Môi trường thạch kiềm

          – Công thức:

Pepton
NaCl
Cao thịt

Thạch

Nước cất
10g
5g
4g

20g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 8,5-9. Hấp 121oC/15 phút. Để nguội 45-500C đổ đĩa 20ml/đĩa.
Môi trường thạch kiềm và môi trường MacConkey

          1.2.4 Môi trường Chap man

          – Công thức:     

Thạch thường
NaCl

Manit

Dung dịch đỏ phenol 1%
1 lít (Xem phần 1.1.2)
65g

10g

3-5 ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,0-7,2. Chỉnh màu bằng dung dịch đỏ phenol 1% (môi trường có màu đỏ da cam). Hấp 121oC/15 phút. Để nghiêng ống thạch cho thạch đông, nếu đổ đĩa thì để nguội 45-500C đổ 20ml/đĩa.

          1.2.5 Môi trường vận chuyển Cary-Blair

          – Công thức:

Cary and Blair Transpot Medium

Canxi Clorua (CaCl2) 1%

Nước cất
12,6g

9ml

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi cách thủy cho tan hết các thành phần và môi trường trở nên trong (không đun sôi trực tiếp). Để nguội 500C thêm 9ml dung dịch Canxi Clorua 1%. Điều chỉnh pH – 8,4. Đóng ống 16mm mỗi ống 8ml. Hấp 1000C/10 phút.
     1.3. Môi trường xác định tính chất sinh hóa
          Môi trường xác định là loại môi trường dùng để nghiên cứu các đặc tính sinh vật hóa học để xác định các loại vi khuẩn gây bệnh.
          1.3.1 Môi trường Ure Indol

- Công thức:     
L-Tryptophan
KH2PO4
K2HPO4
NaCl
Ure
Cồn 900

Dung dịch đỏ phenol 1%

Nước cất
3g
1g
1g
5g
20g
10ml

2ml

1000ml

          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH -7,2, thêm dung dịch đỏ phenol 1%. Đóng vào ống nghiệm 12mm, mỗi ống 1,5ml. Tyndal 2 ngày:                 Ngày thứ nhất: 650C/1 giờ.Ngày thứ hai:  650C/30 phút.

          1.3.2 Môi trường LDC (Lysin Decacboxylaza) – Môi trường ODC (Ornithin Decacboxylaza) – Môi trường ADC (Acginin Dehydrolaza )

          – Công thức:

L. Lysine (hoặc L. Ornithine, hoặc L. Arginin)
Cao men
Glucose

Bromocresol purple (1,6g/100ml cồn)

Nước cất
2,5g
1,5g
0,5g

0,5ml

500ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH -6,5, thêm chỉ thị màu Bromocresol purple tới khi có màu đỏ ánh tím ( màu mận chín ). Đóng ống 12mm mỗi ống 1,5ml. Hấp 121oC/15 phút.

          1.3.3 Môi trường Basikow

          – Công thức: Có thể thay thế Na2HPObằng cao thịt

         Công thức 1                                                                Công thức 2

Na2HPO4
NaCl
Pepton

Nước cất
6g
6,6g

12g

1000ml
Cao thịt
NaCl

Pepton

Nước cất
5g
5g

10g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH -7,2. Cho chỉ thị màu Bromthymol blue 1,5ml tới khi có màu xanh lá mạ. Đóng ống 12mm mỗi ống 3ml cho thêm ống durhar. Hấp 121oC/15 phút.
     II. Môi trường bột khô đóng hộp
          Các môi trường này được làm từ các nguyên liệu và hoá chất tinh khiết nên chất lượng môi trường đảm bảo, việc cân đong pha chế đơn giản tiện lợi hơn. Tuỳ loại môi trường cần hấp khử trùng (có loại môi trường không cần hấp khử trùng) theo chỉ dẫn trên hộp môi trường.

     2.1. Môi trường SS (Salmonella-Shigella)

          – Công thức:

Thạch SS

Nước cất

60g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần trong 5-10 phút. Không hấp, để nguội 45- 500C, điều chỉnh pH 7,0 ± 0,2. Đổ đĩa 20ml/đĩa.
Môi trường thạch dinh dưỡng (NA), môi trường Selenit và môi trường Salmonella-Shigella (SS)

     2.2. Môi trường TCBS (Thiosulfate-Citrate Bile Salts)

          – Công thức:     

Thạch TCBS

Nước cất

88g

1000ml

          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần trong 5-10 phút. Không hấp, để nguội 45- 500C, điều chỉnh pH- 8,6. Đổ đĩa 20ml/đĩa.

     2.3. Môi trường MacConkey (MăcConkây)

          - Công thức:    

Thạch MacCONKEY

Nước cất

50g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH- 7,1 ± 0,2. Hấp 121oC/15phút, để nguội 45- 500C. Đổ đĩa 20ml/đĩa.

     2.4. Môi trường Endo

          – Công thức:      

Thạch ENDO

Nước cất

39g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH- 7,4 ± 0,2. Hấp 121oC/15phút, để nguội 45- 500C. Đổ đĩa 20ml/đĩa.

     2.5. Môi trường Xitrat Simons

          – Công thức:          

Thạch Xitrat Simons – Cittrat

Nước cất

22,5g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần. Điều chỉnh pH 6,6± 0,2. Phân phối vào ống 12mm mỗi ống 3ml. Hấp 1210C/15 phút, để ống môi trường nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2cm.

     2.6. Môi trường Kligler (KIA)

          – Công thức:    

Thạch Kligler

Nước cất

55g

1000ml
          - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần. Điều chỉnh pH 7,2-7,4. Phân phối vào ống 12mm mỗi ống 3ml. Hấp 1210C/15 phút, để ống môi trường nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng dài khoảng 2cm.

     2.7. Môi trường mannit di động

          – Công thức:     

Thạch Mannit

Nước cất

22g

1000ml
         - Cách pha chế: Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, đóng ống 12mm, mỗi ống 3-4ml. Hấp 121oC/15 phút.

                                                                                                                 CN. Nguyễn Thị Phương

                                                                                                      Phòng pha chế môi trường, Khoa Vi khuẩn
ĐẦU TRANG
logo